中国农业大学动物医学院周向梅教授团队在动物结核病致病机制方向取得进展

3月3日，中国农业大学动物医学院周向梅教授团队在《自噬》（Autophagy）杂志在线发表研究论文《Mb3523c蛋白通过伴侣蛋白介导的自噬调控宿主细胞铁死亡》（Mycobacterium bovis Mb3523c protein regulates host ferroptosis via chaperone-mediated autophagy）。该研究揭示了人兽共患结核病主要病原菌牛分枝杆菌的Mb3523c蛋白通过调控伴侣蛋白介导的自噬（CMA），诱导宿主细胞铁死亡进而增强牛分枝杆菌致病性和传播的新机制，为结核病的防控提供新的思路，也为新型疫苗开发和药物靶点设计提供科学依据。

结核病（Tuberculosis, TB）仍是全球重大公共卫生问题，每年导致约 150 万人死亡。牛分枝杆菌作为人兽共患病原菌，能在巨噬细胞内长期存活并引发慢性感染。近年来研究发现，细胞死亡在病原体与宿主的互作中扮演双重角色：一方面，宿主通过细胞死亡清除病原体；另一方面，病原体可利用特定死亡方式促进自身扩散。铁死亡作为一种铁依赖性的程序性细胞死亡，其在结核病中的作用逐渐受到关注。

研究团队对比了高毒力临床株M. bovis N# 与低毒力株M. bovis C68004# 的致病性差异。感染实验显示，M. bovis N#感染小鼠的肺脏和脾脏细菌负荷显著高于 M. bovis C68004#，且伴随 IL-1β、TNF-α 等炎症因子水平升高。组织病理学分析发现，M. bovis N# 感染小鼠肺部出现更多灰白色结节、炎性坏死及钙化病灶，提示M. bovis N# 更易诱导宿主细胞坏死，详见图1。

图1.M.bovis N# 诱导更高水平的肺组织细胞死亡

(A)肺组织中牛分枝杆菌的CFU分析;(B)脾脏中牛分枝杆菌的CFU分析;(C)通过ELISA检测小鼠血清中的IFN-γ水平;(D) TNF水平;(E) IL-1β水平;(F)各实验组小鼠肺和脾脏的代表性图像，显示大体病理变化;(G) Ziehl-Neelsen染色结果，显示小鼠肺组织中牛分枝杆菌的数量;(H) H&E染色的高倍镜下肺组织切片，显示牛分枝杆菌诱导的病变;(I)使用ImageJ软件定量分析肺组织中炎症病变区域的百分比;(J)从不同组小鼠肺组织中分离的肺细胞，用ANXA5处理后通过流式细胞术检测;(K)从小鼠肺细胞中定量检测坏死细胞的比例。

进一步机制研究表明，M. bovis N# 感染显著上调铁死亡标志物（脂质过氧化、GPX4 下调）及坏死性凋亡标志物（p-MLKL），而抑制铁死亡（Fer-1 处理）可显著减少细胞死亡（图 2G-H）。蛋白组学分析显示，M. bovis N#  中 Mb3523c 蛋白表达量显著高于 M. bovis C68004#。过表达 Mb3523c 的 BCG 菌株（BCG:Mb3523c）感染巨噬细胞后，

脂质过氧化水平升高，GPX4 降解加速但并不影响坏死性凋亡相关蛋白的表达；而敲除 Mb3523c 的ΔMb3523c 菌株则表现出脂质过氧化水平降低，GPX4 升高的现象，这提示Mb3523c特异性诱导铁死亡的发生，详见图2。

图2.Mb3523c蛋白特异性的诱导铁死亡的发生

(A-B) 将RAW264.7巨噬细胞分为未感染组（CT）或分别以感染复数（MOI）为10的条件感染M. bovis N#、ΔMb3523c及ΔMb3523c::Mb3523c回补株，持续6、12及24小时；(A) 通过活细胞/死细胞染色法检测坏死性细胞死亡；(B) 通过巨噬细胞培养上清液中乳酸脱氢酶（LDH）释放量评估细胞损伤；(C-D) RAW264.7巨噬细胞未感染或分别以MOI为1、5、10的条件感染上述菌株24小时；(C) 活细胞/死细胞染色法检测坏死性细胞死亡；(D) LDH释放量测定；(E-F) RAW264.7巨噬细胞未感染（CT）或感染菌株（MOI=10，24小时），并分别给予溶剂对照、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1，10 μM）或坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1（Nec-1，40 μM）处理；(E) 活细胞/死细胞染色法检测坏死性细胞死亡；(F) LDH释放量测定；(G) 应用BODIPY C1脂质探针通过共聚焦显微镜分析RAW264.7细胞脂质过氧化水平；感染菌株（MOI=10，24小时）的细胞经溶剂或10 μM Fer-1处理24小时后，进一步以1.5 μM BODIPY C11探针孵育20分钟；红色与绿色荧光分别代表未氧化及氧化态BODIPY C11，标尺：10 μm；(H-I) 对(G)中氧化态（H）与未氧化态BODIPY C11（I）的荧光强度进行定量分析；(J) 免疫印迹法检测感染菌株（MOI=10，24小时）并经溶剂或10 μM Fer-1处理的RAW264.7细胞中GPX4及GAPDH蛋白表达水平；(K) 免疫印迹法检测感染菌株（MOI=10，24小时）的RAW264.7细胞中p-MLKL、MLKL及GAPDH蛋白表达；(L-N) 感染菌株的RAW264.7细胞分析；(L) 菌落形成单位（CFU）法检测分枝杆菌存活量；(M) ELISA法检测IL1β水平变化；(N) ELISA法检测TNF水平变化。所有数据均以三次独立实验的平均值±标准误表示，并采用配对双尾t检验进行统计学分析（*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）。

随后通过RNA-seq筛选发现，Mb3523c 促进Gpx4降解与溶酶体途径相关。研究团队进一步利用CO-IP-MS方法筛选Mb3523c互作蛋白，结果显示Mb3523c 通过 Y237 和 G241 位点与宿主热休克蛋白 HSP90 结合进而激活伴侣蛋白介导的自噬途径（Chaperone Mediated Autophagy, CMA）通路，导致 GPX4 被溶酶体降解，详见图3。

图3.Mb3523c通过溶酶体途径降解GPX4蛋白

(A)火山图显示M. bovis N#和ΔMb3523c株感染的RAW264.7细胞中差异表达基因。红色点表示上调基因，绿色点表示下调基因；(B)差异基因的前11个富集基因集列表；(C) 使用抗HA抗体免疫共沉淀（Co-IP）的蛋白质质谱分析结果；(D) Western blot检测HEK293T细胞中HA-Mb3523c、GPX4和HSP90的免疫共沉淀和表达；（E）Western blot检测不同组细胞中GPX4和HSP90的表达；(F) 通过Western blot检测细胞中GPX4的表达。

通过小鼠感染模型显示，ΔMb3523c 菌株感染后，肺组织细菌载量显著降低，炎症损伤减轻。铁死亡抑制剂 Fer-1能有效阻断 Mb3523c 介导的铁死亡，验证了该通路的关键作用。研究团队还发现，Mb3523c 缺失株感染的小鼠肺部损伤明显减轻，提示其作为减毒疫苗的潜力，详见图4。

图4.Mb3523c蛋白诱导铁死亡促进牛分枝杆菌的致病性和传播能力

(A) H&E染色的高倍镜下小鼠肺组织切片（感染4周）。未感染或感染M. bovis N#、ΔMb3523c和ΔMb3523c：Mb3523c株的小鼠，从感染后第15天开始，每天腹腔注射vehicle、Fer-1（3 mg/kg）或tanespimycin（5 mg/kg）；(B)使用ImageJ软件定量分析（A）中处理的小鼠肺组织中炎症病变区域的百分比；(C)从（A）中处理的小鼠肺组织中检测牛分枝杆菌的CFU；(D)从（A）中处理的小鼠脾脏中检测牛分枝杆菌的CFU；(E)通过免疫组化染色检测4-HNE在（A）中处理的小鼠肺组织切片中的表达；(F)定量分析（A）中处理的小鼠肺组织切片中4-HNE的表达；(G) Western blot检测不同组小鼠肺组织中HSP90和GPX4的表达。

综上所述，该项研究发现了M. bovis诱导宿主细胞铁死亡的重要效应蛋白，并揭示了其通过调控宿主伴侣蛋白介导的自噬诱导宿主细胞死亡的新机制； 鉴定了M. bovis Mb3523c与HSP90蛋白其关键结合位点；提出了靶向M. bovis Mb3523c-宿主HSP90界面抑制M. bovis诱导的铁死亡，进而减弱M. bovis 致病力及传播的治疗新策略，详细图5。

图5.牛分枝杆菌Mb3523c蛋白促进铁死亡介导的致病性和播散

中国农业大学博士生王浩然为论文第一作者，兽医公共卫生安全全国重点实验室周向梅教授为论文通讯作者。该研究受科技部十四五重点研发计划、国家自然科学基金面上项目等资助。